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超高分辨率的长读长测序方法Iso-Seq揭示急性B淋巴细胞白血病中IGH-DUX4易位不平衡表达

版权所有,转载请联系基因市场部
2019-08-01


近日,高分文章利器的PacBio单分子长读长测序技术,以其独特的强势应用Iso-Seq再次助力了B细胞的相关研究。一篇来自于美国孟菲斯圣犹达儿童研究医院计算生物学系,Jinghui Zhang研究团队的文章登上了Nature Communications。在这一篇文章中,作者运用了包括PacBio Iso-Seq在内的技术研究了在一种包含IGH- DUX4易位的B-ALL细胞系Nalm6中,IGH易位事件与其等位基因排斥之间的相互作用。

通过Iso-Seq技术,作者不仅确定了IGH- DUX4易位相关的全长转录本,还通过CCS的方式,准确的定位了全长转录本上SNP的类型,进一步研究了IGH等位基因的不平衡表达。

作为目前仅有的能够同时满足长片段和高准确率的测序方法,Iso-Seq能够在读取全长转录本的同时,更进一步的给出准确的SNP信息从而以Isoform phasing的方式为此类临床研究提供测序方案。




IGH(Immunoglobulin Heavy Chain,免疫球蛋白重链)基因的易位与多种肿瘤疾病相关。其中与急性B淋巴细胞白血病(B-cell acute lymphoblastic leukemia, B-ALL)相关的为IGH-DUX4易位。即DUX4基因序列插入到IGH内部,形成DUX4/IGH融合基因并异常高表达,其存在是B-ALL分类的一个重要新型标志物。而DUX4所处的区域不仅富含GC碱基,还伴随具有抑制功能的D4Z4重复序列,这使得以100-150bp的NGS短读长测序技术往往难以进行深入的分析和研究。


DUX4作为一个转录因子通常情况下并不表达,仅仅在发生染色质松弛时表达,比如在胚胎的卵裂期(2/4/8细胞胚胎)的早期胚胎中,又或是在具有面肩肱型肌营养不良(FSHD)个体的成肌细胞中,当失去了D4Z4重复序列的抑制后,DUX4开启表达。而此研究中,B-ALL相关亚型疾病发生早期出现的IGH-DUX4易位,导致了DUX4的异常激活。

图1:IGH等位基因及IGH-DUX4易位


在该文章涉及的模型中,作者选择了具有IGH-DUX4易位融合的Nalm6细胞系来进行研究。通常在B细胞中,遵循着一个B细胞,一种抗体的原则,呈现IGH等位基因排斥。也就是说在B细胞的发育过程中,只有表达一个IGH等位基因,另一个则出现了沉默。通过比较Nalm6细胞系DUX4的表达明显高于正常卵裂期,符合IGH-DUX4易位融合表达的情况。然而,通过对比IGH相关的功能性基因Igμ,则发现DUX4的表达则相对低很多。这说明IGH-DUX4的易位融合事件,可能发生于沉默的等位基因。


为了对IGH-DUX4的结构有一个更全面的了解,作者采用PacBio Iso-Seq方法,在Sequel 1M芯片上对功能性Igu,IGH-DUX4融合基因,以及反义DUX4的全长转录本进行鉴定。而同时这一方法也有助于研究等位基因特异性的转录本表达,作者据此也提出了在B细胞发育过程中IGH-DUX4易位发生于IGH沉默的等位基因的假设。


图2:IGH-DUX4易位区附近的全长转录本。

(a)在IGH-DUX4易位区附近组装的DNA序列。 

(b)将Iso-Seq CCS reads的定位结果与组装的DNA序列进行对比。包括所鉴定到的功能性Igμ、两个IGH-DUX4融合转录本,以及含有IGHM外显子的反义DUX4转录本。


基于PacBio Iso-Seq的CCS 读取方式,通过环形一致性序列得到的高准确度全长转录本,进而可以获得来自全长转录本的SNP信息。作者基于此进一步的研究Nalm6中两个等位基因的DUX4和IGH基因的表达。IGHM基因座是具有三个SNP的二倍体,呈现IGH野生型的A-A-A与IGH-DUX4融合的T-G-G。而通过Iso-Seq分析显示:

  1. 功能性Igμ的表达仅来自表现为A-A-A的IGH野生型

  2. 反义DUX4的表达完全来自表现为T-G-G的IGH-DUX4融合等位基因。

通过CCS所得到的SNP,准确区分了等位基因的不平衡表达,进而证明IGH-DUX4的表达来自于沉默的IGH等位基因。


图3:PacBio 环形一致性测序(Circular Consensus Sequencing ,CCS)


图4:Nalm6中两个等位基因的DUX4和IGH基因表达图。功能性Igμ和反义DUX4由不同的等位基因表达。其中,IGHM基因座是具有三个SNP的二倍体,呈现IGH野生型的A-A-A与IGH-DUX4融合的T-G-G。


在后续的研究中,作者还发现DUX4的高表达会导致细胞出现凋亡。结合包括Iso-Seq,WGS,Hi-C,ATAC-Seq,RNA-seq在内的多种基因组学分析,作者提出了更进一步的假设:

  • 在早期pro-B细胞发育期间,出现了IGH-DUX4的断裂点。

  • 然而在后期,如果IGH-DUX4易位等位基因被激活,DUX4过表达则会导致细胞凋亡。

  • 因此,只有野生型IGH是具有活力,而IGH-DUX4则出现了沉默。

  • 同时,在相关病人样本中,也同样出现了类似的表达,以及同样检测到了IGH-DUX4的断裂点存在,说明形成于相同的机制。

图5:作者提出的模型假设:在B细胞发育期间IGH-DUX4易位和IGH等位基因排斥之间的相互作用


原文信息:

Tian, Liqing, et al. "Long-read sequencing unveils IGH-DUX4 translocation into the silenced IGH allele in B-cell acute lymphoblastic leukemia." Nature Communications 10.1 (2019): 2789.

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PacBio SMRT测序技术目前只应用于科研。


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